Projets : Projet REFCULTCOLUT – 2007

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Dans le champ du cancer, de nombreuses approches thérapeutiques innovantes visent à restaurer des voies apoptotiques court-circuitées lors du processus d’immortalisation et de transformation. Dans les cancers du col de l’utérus ce sont les papillomavirus humains à haut risque qui sont responsables du mécanisme de carcinogenèse. Suite à l’intégration de leur génome dans celui de la cellule hôte, les deux oncoprotéines virales E6 et E7 sont surexprimées. Celles-ci favorisent, entre autres, la dégradation de p53 et p105Rb respectivement, deux protéines régulant le cycle cellulaire, l’apoptose et l’angiogenèse. Dès lors, la progression tumorale se distingue par une dérégulation de la prolifération cellulaire, une stimulation de l’angiogenèse, et une inhibition des voies d’induction de l’apoptose.

Depuis plusieurs années nous utilisons la staurosporine, un inhibiteur de multiples protéines kinases, pour induire l’apoptose de cellules dérivées de cancers du col utérin et abritant des HPV oncogènes. Cette drogue permet de restaurer une apoptose dépendante de p53 qui est accompagnée d’une réexpression de p53 et de certains de ces gènes cibles pro-apoptotiques (comme bak) (Bernard, 2001, 2003). Par ailleurs, une dépolarisation des membranes mitochondriales est mise en évidence, associée à une localisation mitochondriale de p53, à la libération de cytochrome c, une activation des caspases et finalement au clivage de l’ADN (Bernard, 2003, Charlot, 2004). Nos derniers travaux suggèrent une activité essentielle de p53 au niveau transcriptionnel et mitochondrial dans ce processus apoptotique. Ces activités peuvent d’ailleurs être modulées pharmacologiquement pour favoriser l’apoptose ou protéger les cellules de l’apoptose (Charlot, 2006). Si l’induction de l’apoptose des cellules tumorales est une voie privilégiée de nouvelles thérapies anti-cancéreuses, les corps apoptotiques pourraient dans certaines circonstances favoriser la progression ou la récidive tumorale suite à un transfert horizontal d’oncogènes. En effet, Holmgren et al ont démontré un transfert des gènes du virus d’Epstein-Barr (EBV) dans des macrophages, des fibroblastes et des cellules épithéliales lors d’une co-culture de ces cellules avec des corps apoptotiques issus de cellules lymphoïdes abritant des copies intégrées d’EBV (Holmgren, 2002). Des observations similaires ont été faites à partir de cellules abritant le VIH (Spetz, 1999). Les auteurs de ces deux publications suggèrent que le transfert horizontal de gènes puisse expliquer l’infection virale in vivo des cellules n’exprimant pas le récepteur membranaire nécessaire au processus naturel d’entrée du virus. Il a été aussi démontré par des études in vivo que des fibroblastes ayant phagocyté des corps apoptotiques issus de cellules surexprimant les oncogènes cellulaires H-ras et c-myc sont capables d’induire la formation de tumeurs chez des souris SCID (Bergsmedh, 2001).

L’observation et l’enregistrement d’évènements biologiques à l’échelle cellulaire ou subcellulaire peuvent être facilement réalisés lorsque la durée de l’expérience est relativement courte, de l’ordre de la seconde ou de la minute. La préparation peut être observée directement à l’aide d’un microscope, des photographies prises à des temps réguliers et comparées point par point de façon précise. En revanche, si la durée de l’expérience est beaucoup plus importante, de l’ordre de l’heure, de la journée ou plus, des systèmes de documentation plus sophistiqués deviennent nécessaires. Ainsi, la vidéomicroscopie répond à ces besoins, mais cette approche nécessite un équipement spécifique conséquent qui doit être monopolisé durant de longues périodes. Nous avons donc besoin de microsystèmes capables d’enregistrer de façon systématique la position d’une zone observée en microscopie optique de sorte à la retrouver facilement lors d’observations ultérieures (par exemple après mise en culture ou traitement par une drogue) et de superposer les images de façon numérique afin d’identifier de façon extrêmement précise les modifications à l’échelle cellulaire et subcellulaire. Les solutions actuelles sont basées sur des platines de microscope motorisées qui sont incapables de gérer le positionnement des préparations sur la platine elle-même.

Nous avons récemment développé une approche tout à fait originale qui consiste en l’intégration d’un référentiel de position au support même de la préparation biologique (Sandoz, 2007). Ainsi nous nous rendons indépendants du positionnement de la préparation sur la platine du microscope. Le principe utilisé est représenté sur la figure 1. Une mire pseudo-périodique est gravée en profondeur du support d’échantillon ou à la surface d’une lamelle couvre-objet. On enregistre alors deux images successives pour deux profondeurs de mise au point différentes. La position et l’orientation dans le plan calculées à partir de la mire codée (Sandoz 2000, 2002, 2004) sont donc affectées à l’image biologique qui se trouve ainsi référencée en position. Les traitements numériques développés gèrent les données et assurent le repositionnement des images, soit pour retrouver la même zone sous le microscope, soit pour superposer numériquement plusieurs images.

Le repérage d’une zone aléatoire de la préparation impose des contraintes sur le système de codage de la position par la mire. La solution adoptée est basée sur un codage pseudo-aléatoire à mots binaires imbriqués et dont chaque bit est codé par la présence ou l’absence du point correspondant. Les lacunes observées sur la figure 1b sont la partie visible du code intégré à la mire initialement périodique de codage de position. En fait la trame périodique fournit la précision de la mesure tandis que le code binaire formé par la position des lacunes lève les ambiguïtés de nombre de périodes et fournit la position absolue.

Dans la technique de mots binaires imbriqués, les (N-1) derniers bits d’un mot correspondent aux (N-1) premiers bits du mot suivant et ainsi de suite. De cette façon on obtient une suite binaire linéaire continue codant 2N positions et dont l’observation de N bits consécutifs suffisent à retrouver la position dans la suite. Ainsi, quelque soit la zone observée, on est capable de retrouver la position correspondante à condition d’identifier correctement N bits consécutifs. Le codage dans la direction perpendiculaire est assuré par une reproduction de ces lignes pseudo-aléatoires dont les décalages relatifs indiquent de façon unique la position selon la deuxième direction. La mire que nous avons actuellement à notre disposition permet une observation et un codage optimal avec un objectif 20X.